富血小板血漿在口腔頜面外科應用的研究趨勢

日期：2013-08-29

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是自體源性、濃縮的含人血小板的血漿,是全血經過離心、分離而得到的血小板濃縮物，亦稱之為血小板凝膠、富生長因子血小板或自體濃縮血小板。PRP富含由血小板分泌的七種與所有創傷愈合過程有關的蛋白生長因子。這些生長因子包括3種同分異構體的血小板衍生生長因子（PDGFαα,PDGFββ,PDGFαβ），轉化生長因子-β1（TGF-β1）、轉化生長因子-β2（TGF-β2），表皮樣生長因子（EGF），血管內皮生長因子（VEGF），成纖維細胞生長因子（FGF），胰島素樣生長因子（IGF）等［1，2］，它也含有血液中存在的3種蛋白質:纖維素、纖粘連蛋白及親玻粘連蛋白［3］。這些因子對促進細胞的增殖與分化及組織的形成有著極其重要的作用。

　　1  富血小板血漿的制備及原理

    目前，PRP制備方法已明顯簡化，在普通條件下于手術室即可以制備。但在離心過程中必須保持無菌，并且在沒有血小板溶解或破壞的高濃度下分離。不同的PRP儀制備的PRP結果不同。有些PRP儀不能產生足夠數量的、促進愈合的濃縮的血小板，這可以解釋許多關于使用PRP無效的研究。真正的PRP應是自體的，因異體血小板沒有活力，且不能分泌生物活性生長因子，其細胞膜亦是抗原，可刺激機體產生抗體。

    PRP制備方法大致分為兩類。一類通過手工操作，利用離心機等簡單儀器在普通血庫條件下制備，易于開展，但操作步驟較為繁瑣；另一種方法為使用專門的血液分離儀器自動分離制備PRP。此法簡單迅速，可將分離后剩下的血液成分及時回輸到患者體內。制備PRP時，需要在血液中加入抗凝劑，常用抗凝劑為10%檸檬酸鈉和EDTA。使用時，在PRP中加入凝集劑10%氯化鈣和凝血酶，使其形成凝膠，可起粘結作用；同時將生長因子限制在凝集塊內不易流失，有利于其發揮作用，且容易成形。

    不同的離心次數、離心力和離心時間制備的PRP中所含血小板濃度和活性同制備時的離心次數、離心力和離心時間有明顯因果關系，不同制備方法獲得的PRP中血小板的濃度為全血中的1.9~10倍［1，8，9］。其制備原理相同：即抽取全血，利用血液中各組分的沉降系數不同經梯度離心，將血液分為3層，底層為沉降系數最大的紅細胞，最上層為上清液即乏血小板血漿（platelet-poor plasma,ppp），兩者交界處有一薄層（buffy coat），一般肉眼不易看出，即富血小板血漿層。然后提取上清液及交界處以下的一部分紅細胞，改變離心力再次離心，即可得到含有高濃度血小板的PRP。當離心力大于250 g時，會過多破壞血小板；離心時間小于5 min時，PRP中血小板濃度與全血中血小板濃度無顯著差別。為此提示：離心以200 g離心力、10 min離心時間為最佳。也可將獲得的PRP進一步濃縮，得到濃縮的PRP(concentrated platelet-rich plasma,cPRP),可以使血小板濃度進一步提高至全血的16倍。

　　2  PRP可能的作用機制

    目前對于PRP促進骨再生的機制尚未完全闡明。可能的作用機制是：PRP與凝血酶、氯化鈣混合形成凝膠，其中所含的血小板α顆粒釋放生長因子而起作用。其中最重要的是PDGF和TGF-β。這些生長因子在凝集十分鐘后開始分泌，因此，PRP必須在凝集開始后十分鐘內、在抗凝狀態下制備并應用。凝集時，血小板被激活，α顆粒與血小板膜融合，通過添加組蛋白及醣側鏈而成為活性狀態，生長因子通過跨膜受體結合到細胞膜外表面。研究表明，成人骨髓基質干細胞、成骨細胞、成纖維細胞、內皮細胞及表皮細胞表達PRP中相關的生長因子受體。這些跨膜受體反過來誘導內源性的細胞內信號蛋白的活性，引起細胞增殖、血管生成、基質形成、膠原合成等細胞的基因序列表達。PDGF為一種糖蛋白，可刺激骨髓基質細胞的有絲分裂，增加成骨細胞的數量；也可刺激內皮細胞的生長，促進受植區的毛細血管的生成；刺激單核巨噬細胞趨化。TGF-β可激活成骨前體細胞趨化及有絲分裂，刺激膠原基質沉淀，抑制破骨細胞形成及骨吸收；血管內皮生長因子（VEGF）是強有力的血管生成因子，可促進創口愈合及血管化。
    骨修復是一個長期的過程，而血小板在創口中的壽命僅有7 d，一旦顆粒耗盡，即相繼死亡。在生長因子作用下的骨髓基質細胞轉化為成骨細胞的活性及數量增加，成骨細胞本身也分泌TGF-β作用于鄰近細胞及自身，形成良性循環。巨噬細胞也被血小板刺激后通過血管到達移植區，通過分泌巨噬細胞源性生長因子及其它因子承擔調節創口愈合的功能。

　　3  PRP 在口腔頜面外科的應用

    頜骨由于其解剖及功能上的特殊性，其缺損的修復一直是口腔頜面外科臨床所面臨的難題之一。傳統的頜骨重建方法主要有自體骨移植、異體或異種骨移植、人工合成生物材料等,存在著骨源有限、傳播疾病、相容性及無誘導活性等缺陷。近期甚為活躍的組織工程化人工骨雖然有非常良好的應用前景，但是由于存在種子細胞需分離純化、體外擴增及誘導成骨細胞方向分化等程序需時較長，而支架材料的物理、化學性能、組織相容性及降解率等與種子細胞的復合尚缺乏有效的調控，生長因子的適宜比例難以確定 ，故臨床應用還有很長的路要走。因此，骨缺損的再生與重建是當前的熱門研究課題之一。

    應用PRP行頜骨缺損的重建是近期提出的一個研究方向,并且已有在頜面部根治性外科切除術后、頜骨重建、牙槽嵴裂的修復、牙種植外科及其它相關的骨科領域成功應用的報道。

    在頜面部根治性外科切除術后遺留一些重要的硬組織及軟組織缺損。對這些缺損的修復主要是功能性修復。優先的重建方法為：1）在手術切除時骨的穩定及軟組織的重建；2）延遲進行骨的定形重建，讓軟組織創口愈合。在手術過程中常規應用PRP，當軟組織分層縫合時，在組織下應用一厚層的血小板凝膠，利用其凝膠的性質止血及粘結組織瓣關閉創口，通過凝膠內血小板的激活及前述的生長因子產物的釋放促進創口愈合。

    自體血小板凝膠復合顆粒松質骨及骨髓（PCBM）壓縮在異體或異種支架內，使移植物可獲得足夠的、充實的填充置入。除了可粘結軟組織瓣以外，凝膠內的血小板還可釋放大量的生長因子促進創口的愈合。應用此項技術的所有病例均能滿足Marx的下頜骨重建的成功標準。然而因受區軟組織切除后常造成與口腔交通，導致移植物繼發感染而失敗達35%。在這種情況下將穿通處采用荷包縫合，應用一層PRP凝膠，可避免感染或移植失敗。應用顆粒松質骨及骨髓復合自體纖維素凝膠（autologous fibrin adhesive,AFA）重建腫瘤根除術后遺留的下頜骨節段性缺損。術后隨訪，全景片結果顯示骨重建在4周時顯著。用PRP干預體外培養的骨髓基質細胞，發現PRP加速骨髓基質細胞的生長，基質細胞定向分化為成骨細胞后的成骨活性較單純培養細胞高，分泌ALP及形成鈣鹽的能力強，細胞增殖及分裂數目顯著高于對照常規培養組。應用復合PRP移植骨修復下頜骨缺損，結果復合PRP移植骨是單純移植骨修復速度1.62~2.16倍，骨密度為（74.0±11）%高于對照組骨密度（55.1±8%），（P<0.005）。

    應用PRP復合多孔礦化牛骨誘導組織再生（PRP/BPBM/GTR）與GTR治療人牙周骨缺損，術后3周傷口完全愈合，PRP/BPBM/GTR組袋深度為2.83~2.89 mm, GTR組牙周袋深度為4.13~4.16 mm。臨床上皮附著水平PRP/BPBM/GTR組比GTR組增加為1.75~1.84 mm;齦退縮水平兩組間無明顯差別；PRP/BPBM/GTR 骨缺損充滿平均為4.66~4.78 mm,GTR組為2.26~2.31 mm,兩者間差別有統計學意義。

    口腔種植技術常面臨的難題之一是局部骨量不足的問題。嚴重的牙槽嵴萎縮常不能行種植體植入。垂直向的下頜骨萎縮可通過牽引成骨解決，牽引成骨期間成骨前體細胞向成骨細胞的增殖及分化，此過程依賴于局部血管化及足夠的血供。PRP中的PDGF可促進骨生成，術后60 d時X線檢查新生骨有早期礦化的跡象；牽引器去除后可見未重建的編織骨，但可以維持種植體的穩定。上頜后牙區牙槽骨高度不足時，行種植體植入時常易造成上頜竇底黏膜穿通致種植體周圍感染而失敗。此時應用自體髂骨復合PRP竇底提升技術，同期行種植體植入與未復合PRP的竇底升高術相比愈合時間縮短了1/3。用Bio-Oss復合自體PRP上頜竇提升同期植入骨內牙種植體， 4周時骨密度達到或超過鄰近正常骨密度，可以負載修復體，比沒有復合PRP的Bio-Oss時間縮短3~4倍。

　　4  PRP的應用前景及存在的問題

    PRP中含有高濃度的生長因子，且完全是自體的，具有與體內類似的比例，滿足了早期骨愈合所需的生長因子的需要；同時其自身所具有的粘合性有利于移植物的粘附、防止生長因子的流失及骨骼的愈合與修復，而且使用方便。其生長因子不進入細胞內或細胞核內，使正常的愈合過程加速，無致畸作用,也不具有誘導腫瘤形成的能力。因此，復合PRP的移植骨是一種安全的、簡便的、價廉的解決頜骨缺損、牙周骨缺損、種植前骨缺損修復的外科方法。

    由于PRP用于骨再生是近幾年才發展起來的，目前還存在許多尚待解決的問題。首先，目前PRP制備尚無統一的標準，未能建立制備高效穩定PRP制備方法；其次，不同方法制備PRP所含血小板數量差異很大，PRP中血小板數目與促進骨再生最佳量效關系尚不能確定；還有， PRP中不同生長因子的生物學特性、生物學作用及促進骨再生的機制目前尚未完全闡明。有學者對PRP促進骨再生的效果持懷疑態度。他們分別應用PRP復合自體骨、Bio-oss、有機骨基質等，未能得到PRP有效促進骨再生的證據。因此，目前關于PRP還有許多尚待解決的問題，在臨床應用以前應實行循證醫學，建立可靠的、可重復的動物模型；然后設計嚴格的、標準化的人群試驗。